ΕΕ1 Χαρακτηριστικά του ώριμου τμήματος που ενεργούν ως σήματα στόχευσης/έκκρισης

Στόχοι

1. Βιοπληροφρική ανάλυση για να προσδιοριστούν τα χαρακτηριστικά ακολουθίας στις εκκριτικές προπρωτείνες 

2. Προσδιορισμός τμήματων της ώριμης ακολουθίας που είναι απαραίτητες για τη στοχοθέτηση και την έκκριση 

3. Προσδιορισμός του αν τα πεπτίδια-οδηγοί πρέπει να συνδυαστούν με συγκεκριμένα ώριμα τμήματα 

Για τον προσδιορισμό των σημάτων στοχοθέτησης σε όλη την πρωταρχική αλληλουχία του ώριμου τμήματος της προπρωτεΐνης θα χρησιμοποιήσουμε προηγμένες μεθόδους βιοπληροφορικής. Ακολουθίες των ~ 400 εκκριτικών πρωτεΐνών του E.coli, θα πρέπει να συγκριθούν με εκείνες των 2.500 ~ του κυτταροπλάσματος εκείνα που χρησιμοποιούν γενιά του μοντέλου εκπαιδεύονται με τις μηχανές διανυσμάτων υποστήριξης.

Για να προσδιορίσουμε πειραματικά μια ελάχιστη περιοχή προπρωτεΐνης που αρκεί για τη στόχευση στη μεταθετάση και την έκκριση θα περικόψουμε το καρβοξυτελικό άκρο της proPhoA. Τα παράγωγα μόρια θα πρέπει να δοκιμαστούν σε in vitro λειτουργικές δοκιμασίες για α. Στόχευση, δηλαδή δεσμευση στη μεταθετάση, β. τη μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης της μεταθετάσης, γ. την τόνωση της SecA ΑΤΡάσης δ. έκκριση. Για να κατανοήσουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ πεπτίδιου / ώριμου τομέα θα συντήξουμε 30 γηγενή και μη λειτουργικά πεπτίδια-σήματα μπροστά από το ώριμο τμήμα της PhoA. Πρωτεΐνες-προιόντα σύντηξης, θα δοκιμαστούν λειτουργικά in vitro.

ΕΕ2 Χαρακτηριστικά του ώριμου τμήματος που λειτουργούν  ως μη-γραμμικά σήματα στόχευσης/έκκρισης

Ιστορικό και στόχοι 

Για να ξεκινήσει η ανάλυση της δομικής βάσης της μετατόπισης εκτελέστηκαν προκαταρκτικά πειράματα σκοπιμότητας με proPhoA παρουσία ή απουσία αναγωγικού παράγοντα (εφεξής «μη εγγενείς» και «διπλωμένες» μορφές). Σε αυτές περιλαμβάνονται: 

α. Χρωματογραφία μοριακής διήθησης (GPC), σε συνδυασμό με σκέδαση φωτός πολλαπλών γωνιών (MALLS) και σε οιονεί ελαστική σκέδαση (QELS) για να καθοριστεί η εγγενής μάζα και η υδροδυναμική διάμετρος της proPhoA. Η μη εγγγενής proPhoA επιμηκύνεται σημαντικά σε σύγκριση με την αναδιπλωμένη κατάσταση (8,4 έναντι 6,4 nm). 

β. Μέτρηση της ανταλλαγής υδρογόνου-δευτερίου (HDX) σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (MS) αποκάλυψε ότι η μη-εγγενής proPhoA υφίσταται εκτενή ανταλλαγή, ενώ, η αναδιπλωμένη proPhoA ανταλλάσει πρωτόνια πολύ αργά ή και καθόλου. Συλλογικά, τα πειράματα δείχνουν ότι η ικανή για μετατόπιση proPhoA υπάρχει σε μορφή τετηγμένου-σφαιρίδιου (MG), μία κατάσταση κατά την οποία οι πρωτείνες έχουνε αποκτήσει δευτερεύουσα, αλλά όχι μητρική τριτογενή δομή. Οι στόχοι του ΠΕ2 είναι: 

1. Χαρακτήρισμός της μη-εγγενούς διαμόρφωσης των ώριμων τμημάτων που είναι απαραίτητη για τη στόχευση/έκκριση. 

2. Προσδιορισμός του αν τα πεπτίδια-οδηγοί επηρεάζουν τη μη-εγγενή διαμόρφωση του ώριμου τμήματος 

Για τον καλύτερο χαρακτηρίσμό της MG, η προκαταρκτική HDX-MS ανάλυση θα οριστικοποιηθεί. Επιπλέον, πολλά επιπλέον εργαλεία θα χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση της MG: a. NMR. β. UV φασματοσκοπία CD. γ. Φθορισμός Trp και 8-anilinonaphthalene-1-σουλφονικού οξέος. δ. φασματομετρία μάζας ιοντικής κινητικότητας (MS-ΙΜ) για να διαχωρίσει γρήγορα διαφορετικά διπλωμένες περιοχές. Ωριμη  PhoA και PhoA με συντήξεις με διαφορετικά πεπτίδια-σήματα θα πρέπει επίσης να αναλυθούν, προκειμένου να διαπιστωθεί εάν η MG είναι μια θεμελιώδης ιδιότητα του ώριμου τομέα και αν τα πεπτίδια-οδηγοί μπορούν να επηρεάσουν την MG. Για τον προσδιορισμό της οικουμενικότητας των χαρακτηριστικών της proPhoA θα χρησιμοποιήσουμε 10 επιπλέον προπρωτείνες. Ακριβώς όπως με proPhoA μπορούμε να διατηρήσουμε όλες αυτές τις πρωτεΐνες σε μια κατάσταση ικανή για μετατόπιση. MG κράτη τους θα χαρακτηρίζεται (όπως παραπάνω για proPhoA). Χρησιμοποιώντας πληροφορίες από ΠΕ1 και υπολείμματα πληροφοριών σε εθνικό επίπεδο από τα κράτη μέλη HDX-πειράματα (ΕΕ1), θα χαρτογραφήσει την ακριβή τοποθεσία του ώριμου τομέα στόχευση σήματα που προσδιορίζονται εδώ σε 3D δομή του κρυστάλλου του εγγενώς διπλωμένο proPhoA.

ΕΕ3 Μοριακή βάση της αποκρυπτογράφησης της προπρωτεΐνης μη ιθαγενή στόχευση/έκκριση κώδικαΣτόχοι 

1. Ανάλυση των συμπλόκων μεταξύ των τριών σαπερονών με διαφορετικές προπρωτείνες

2. Προσδιορισμός δομών υψηλής ανάλυσης

3. Προσδιορισμός των σαπερονών που δεν μπορούν να διαβάσουν το μη-εγγενή κώδικα των προπρωτεΐνών. 

TF, SecB και SecA θα αναμειγνύονται με μια ομάδα προπρωτεινών και παράγωγα τους με καρβοξυτελικές ελλείψεις που μπορούν να διατηρούνται σε διαλυτή, ικανή προς μετατόπιση μορφή και που καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα μαζών. Τα σύμπλοκα που προκύπτουν θα πρέπει να αναλυθούν με GPC-MALLS/QELS για να χαρτογραφήσουμε τα πιθανά ζεύγη αλληλεπιδράσεων, τη στοιχειομετρία και τη συγγένεια πρόσδεσης. Επιπλέον, θα αποκτήσουμε σαφείς μετρήσεις μάζας από ESI-Q-TOF/MS. Τέλος, για την εξακρίβωση των θερμοδυναμικών παραμέτρων, συγγένειες και για επιβεβαίωση της στοιχειομετρίας θα χρησιμοποιήσουμε θερμιδομετρία Ισοθερμης τιτλοδότησης (ITC). Συνολικά, οι μελέτες αυτές θα αποκαλύψουν τις θεμελιώδεις αρχές της αλληλεπίδρασης συνοδού-προπρωτεΐνης. Για να χαρτογραφήσουμε την αλληλεπίδραση της συνοδού με το MG θα χρησιμοποιήσουμε HDX-MS. Οι περιοχές δέσμευσης θα είναι λιγότερο επιρρεπείς σε ανταλλαγή στα αμιδικά πρωτόνια τους. Επιπλέον, θα αναλύσουμε τις αλλαγές στο MG αυτών των συμπλόκων κάνοντας χρήση IM-MS. Για να αποκτήσουμε ατομική λεπτομέρεια σχετικά με το τι είναι τα σήματα στο  MG που «διαβάζουν» οι συνοδοί θα χρησιμοποιήσουμε κρυσταλλογραφία και NMR. Για τα πειράματα NMR, έχουν ήδη ολοκληρωθεί εργασίες για TF, SecB και SecA. Το Nonaco θα επικεντρωθεί ειδικότερα στην πλήρη εξέταση συμπλόκων συνοδών-προπρωτεΐνης. Γι' αυτό, αντί, της απαγορευτικά μεγάλης proPhoA θα χρησιμοποιήσουμε βραχείες προπρωτείνες. Για να προσδιοριστεί αν άλλες συνοδοί μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τη μορφή MG των προπρωτεινών ένας αριθμός σαπερονών (π.χ. DnaK / DnaJ / GRPE) θα πρέπει να ελέγχθούν με τη βοήθεια των βιοφυσικών δοκιμασιών που περιγράφονται παραπάνω.

ΕΕ4 Επικύρωση in vivo και συστημική προσέγγιση της σάρωσης του μη εγγενούς κώδικα

Στόχοι

1. Χαρακτηρισμός in vivo του επιδραστικού πρωτεινώματος (interactome) διαφόρων προπρωτεινών

2. Επικύρωση πρωτεΐνικών παραγόντων που αλληλεπιδρούν με μια αλυσίδα προπρωτεΐνης υπό διάφορα καθεστώτα 

Για μια αμερόληπτη, συστημική προσέγγιση για νέους παράγοντες που δεσμεύουνε προπρωτεΐνες θα καθιζάνουμε μόρια ProPhoA και παράγωγα με καρβοξυτερικές ελλέιψεις και μαρκαρισμένες με ολιγο-ιστιδινικούς επιτόπους. Βακτηριακά στελέχη στα οποία θα λείπει η SecB, ο TF ή και τα δύο θα χρησιμοποιηθούν. PhoA χωρίς οδηγό πεπτίδιο που δεν μπορεί να εκκρίνεται θα χρησιμοποιηθεί ως εσωτερικός μάρτυρας για να προσδιοριστει το ποιοί παράγοντες αναγνωρίζουν την MG-κατάσταση ειδικά. Απομονωμένοι παράγοντες μετά από συγκατακρήμνηση θα προσδιοριστούν με εκ των κάτω (bottom-up) πρωτεϊνωματική και οι αλληλεπιδράσεις τους θα αναλυθούν με θεωρία δικτύων. Όπως και με την proPhoA, επιπλέον προπρωτείνες θα δοκιμαστούν. Για να ξεπεραστεί η απώλεια παροδικών αλληλεπιδράσεων και για να εντοπιστούν οι περιοχές της αλληλεπίδρασης θα κάνουμε χρήση θεσηκατευθυνόμενη, φωτοενεργοποιούμενη χημική διασύνδεση με χρήση BPA. Το BPA θα ενσωματωθεί σε προπρωτείνες χρησιμοποιώντας amber κωδικόνια λήξης.



Coil and Globule (credits)